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水稻基因组DNA提取方法的研究进展

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  摘要:水稻基因组DNA的提取方法主要有SDS法和CTAB法。在此基础上又提出了快速制备法、简易提取法、无需液氮研磨提取法、微量提取法等多种方法。从试验提取材料、方法等方面对以上各种方法的优缺点及应用范围进行了综述。
中国论文网 http://www.egsf.org/8/view-8871975.htm
  关键词:水稻;基因组DNA;提取方法
  中图分类号:S511;Q78 文献标识码:A 文章编号:0439-8114(2010)04-0968-04
  
  水稻是世界上最主要的三大粮食作物之一,已被列为模式作物,有着丰富和深入的基因组研究基础。其DNA的制备是深入进行分子生物学研究的前提。为使所得DNA纯度高,断裂降解程度小、量足,在提取时应根据不同研究需要,保证其结构的相对完整性;尽量排除其他大分子成分如蛋白质、多糖等的污染。前人已就植物基因组DNA的提取总结了一系列的方法,如SDS法、CTAB法。但在DNA提取过程中,有机试剂处理次数过多,所得DNA分子片段偏小,纯度不高,得率也低。且CTAB等试剂价格昂贵,增加了成本。目前,针对不同的研究目的和试验需要,提取水稻基因组DNA的材料和方法的侧重点不尽相同,各有其优缺点。
  
  1 材料
  
  目前提取水稻基因组DNA所用的材料主要有:水稻干种子、幼嫩茎段、叶片、幼穗老叶、发芽幼苗等。不同材料对提取的DNA纯度和浓度以及所适用的范围也不同。研究表明,植物组织中的多糖及其他一些次生代谢产物,如脂、萜等?;岫訢NA的提取造成很大的困难,而且这些物质的含量随植物组织器官的生长而增加,如果不能有效地去除,植物组织中的酚类物质会氧化成醌,溶解在抽提液中与蛋白质、DNA结合。影响DNA的解链或降低Taq酶的活性。而使提取出来的DNA限制性内切酶无法酶切。所以,在DNA的提取过程中必须将酚类、多糖和蛋白质等化合物除去。为了避免上述物质的影响。在选取材料时,应尽可能挑取处于生长旺盛期的幼嫩组织。所以在以往的研究中大多数学者都以水稻新鲜叶片或幼苗或水稻幼嫩茎段作为提取材料。但在进行品种鉴定和纯度分析时,用新鲜幼叶或幼苗提取DNA,不仅费时费成本,而且需要液氮。而用水稻单粒种子制备水稻DNA与幼叶相比较其操作简便,省时省力且具有良好的重复性。一般来说DNA提取效果以愈伤组织和幼叶最佳,比如在采用剪切法提取DNA时,以幼穗为材料所提取的DNA纯度比幼叶及老叶提取的质量要高,PCR效果较好。从所提取的DNA浓度和质量方面来比较,幼叶提取的DNA浓度较高,需要稀释后才可用,而单粒种子所提取的DNA质量和浓度适中,DNA条带清晰,没有降解,可直接用于PCR扩增。
  
  2 提取方法
  
  2.1传统提取法
  2.1.1 SDS法这种提取方法利用高浓度的离子去污剂SDS使DNA与蛋白质分离,在高温(55-65℃)条件下裂解细胞,使染色体离析。蛋白质变性,离心后除去沉淀。上清液用酚/氯仿抽提后用乙醇沉淀液相中的DNA。与CTAB法相比,SDS法步骤简单,用时少,但DNA纯度低,扩增效果差,也用到了一些对人体有害的试剂,安全性不高。但相对于其他快速简易提取法,其步骤还是繁琐、时间长。因此,不能满足现代分子生物学研究中大批量组织DNA分析的需要。为此。有学者在SDS方法的基础上提出了剪切法、液氮法和钢珠法。这3种方法的步骤大致相同,原理相通,主要不同点在于对叶片的破碎方法。三者中剪切法和液氮法提取的基因组DNA的条带亮度高,钢珠法低。而且剪切法不需要研磨,不需要灭菌,节省时间,不用液氮研磨,节省成本,同时避免了研钵中残留物的污染,提取的数量多,PCR结果稳定,重复性也好,所以经济实惠,是实验室提取水稻基因组DNA的一种好方法。在其操作步骤中,65%水浴过程很重要,时间过短,则DNA得率不高,时间过长则由于DNA酶的作用很容易造成DNA的降解。若只需少量的DNA,水浴时间可以缩短。水浴过程中要尽可能让SDS充分与材料反应,尽可能完全地破碎细胞膜,释放DNA,所以必须不时将反应体系轻轻颠倒混匀。
  2.1.2 CTAB法CTAB法也是目前应用比较广泛的传统提取方法,其提取质量和产量都比较高。以水稻干种子为材料,采用CTAB法提取得到的DNA,经过纯化和RNA酶处理,纯度较高,显示一条清晰的DNA带:从RAPD扩增结果看,CTAB法获得的模板DNA,每个引物均可扩增出清晰的条带。但此方法操作非常繁琐。耗时耗力,所用试剂对人体有毒,且成本较高。针对其操作繁琐等缺点,在此基础I-3L发展起一种快速简单的方法,35 min之内提取到基因组DNA。该方法在CTAB抽提液的用量及加入氯仿/异戊醇离心的时间和次数等方面有所改进。它秉承了CTAB法高产率、高纯度的优点,同时又大大简化了CTAB法繁杂的操作过程。此方法操作简单、快捷、经济、可靠(能有效降低提取过程中基因组DNA的降解),经电泳和PCR验证,所提取的DNA其含量和纯度与CTAB法所提取的DNA相当,所提取的DNA平均大小在23 kb以上,没有明显的降解,而传统CTAB法所提取的DNA略有降解。
  
  2.2快速制备法
  2.2.1
  煮沸法此方法只需取0.1 g新鲜水稻叶片于液氮中研磨,粉末悬浮于200μL TE缓冲液。在沸水上煮1-10min,冰浴10 min。于室温下13 000r/min离心5 min。将上清储存在-20℃中即可用于PCR。由于用的试剂少,因此成本较低。本方法可以用于转基因植株的快速筛选,具有良好的重复性。
  2.2.2微波炉法其步骤比较简单,省时省力,只需取水稻叶片于液氮中研磨,粉末置于离心管里,盖上盖子,在700 w家用微波炉中高热处理5 min,再加100 μL TE,振荡,13 000 r/min离心2~5 min。将上清液储存在20℃。即可用于PCR。该方法没有用到SDS法,CTAB法中所用到的那些有毒试剂,因此安全性高,费用也较低。
  2.2.3碱处理法采用碱处理水稻嫩叶,其浸出液直接用作PCR扩增的模板,扩增结果稳定、准确。与常规法提取的DNA扩增效果相比没有显著差异,用此方法制备的DNA室温下2周之内、4℃下3周之内、-20℃下4个月以上扩增结果不变。所需试剂均为常规试剂,具有需要材料少、成本低、简便、快捷等优点,尤其适合材料比较贵的转基因水稻的预筛选和大量样本的PCR,且扩增结果与CTAB法相比无差异。虽然碱处理的叶片浸出液中含有蛋白质等大量杂质,但似乎并不影响PCR引物与模板的结合。而且用浸出液直接作PCR扩增的模板,不需要改造的PCR缓冲液,对试验条件要求也不严格,而扩增结果稳定可靠。也有试验用此方法制备模板对水稻细胞质雄性不育系进行纯度鉴定,发现效果良好。
  
  2.3简易提取法   此方法的特点是用NaOH溶液抽提基因组DNA,其DNA可以在短期内保存,在PCR分析中其效果与用常规CTAB法提取的DNA相当。本方法以DNA碱裂解法为原理,在大量预备试验的基础上,采用“一管两步”――一个离心管。研磨、离心两个步骤即可完成模板制备,仪器设备单一、步骤过程简略,大大提高了样品DNA的提取速度,每人每天可提取几百个样品,为能在短时间内进行大量样品的PCR分析提供了条件,大大降低了DNA提取的成本,满足了DNA提取的快捷省时、经济有效且安全性高的要求。虽然本法提取过程十分便捷,但在提取过程中仍需注意,为了防止DNA片段的过度降解,材料捣碎要快速有力,并尽快加入等量的Tris-HC1(pH值为8)缓冲液,防止NaOH对DNA产生降解。同时,如果要保存样品DNA,可吸取适量上清液到另一干净离心管中,于20℃下贮存备用(可至少保存2个月),以便重复PCR扩增或再次检测鉴定,使试验结果更加准确,且实用方便。
  在上述方法上,研究者还提出了CS法,其材料、原理、试验步骤以及所用仪器与上述简易方法相同,只是用CS法提取DNA时比上述简易方法少了一步在加入NaOH前的离心,但提取的DNA质量相当。
  
  2.4无需液氮研磨提取法
  2.4.1幼苗单株快速提取法本法可快速提取基因组DNA,无需液氮研磨、氯仿抽提,提取的DNA经琼脂糖凝胶电泳检测,其质量也好,扩增结果稳定可靠,能满足SSR-PCR的需要。由于其省略了液氮研磨、氯仿抽提等步骤,大大降低了成本和有害试剂对人体的毒性,且快速有效,可以在1d内提取大量样品。使用本方法需要注意的是,由于没有用酚、氯仿进行抽提。含有多糖、蛋白、色素等杂质,因此样品的保存时间不宜过长,一般为2周左右,而且扩增时DNA用量不宜过多,否则会影响PCR效果;此外在提取过程中材料用量也不宜过多,否则容易造成提取失败,一般以5-20 mg为宜。
  2.4.2简单快速,该方法提取DNA不需要液氮研磨、长时间温浴及反复离心及对叶片进行剪碎、研磨等前处理等步骤,提取液只用到了NaOH和Tween20。所以就不需要太多的仪器设备,安全性高。此方法直接用0.2mL PCR管进行DNA的提取,而其他方法一般都用1.5 mL离心管提取,要进一步提高效率很难。它通过简单的加热、稀释等操作便能制备100个PCR反应的DNA模板,1 h能提取96个样品的DNA??朔顺9鍰NA提取过程比较复杂且费用高的缺点。
  2.4.3单粒种子提取前面所提到的两种方法虽然没有液氮研磨,氯仿抽提等步骤,但却用到了SDS和CTAB等有毒化学药品。而此方法不用液氮研磨,不用氯仿、SDS、CTAB等有毒化学药品。只用到了NaOH和HC1试剂,所以费用便宜也安全,且用量小,无需离心,不需要更换离心管,大大降低了提取DNA的成本。试验步骤少,简单,省时,试验表明其提取的DNA适用于转Bt基因水稻检测,也适合于SSR扩增的要求,可用于种子真实性和纯度的快速鉴定。是一种适合于大批量的单粒种子DNA提取方法,这对于用分子标记方法检测种子纯度特别适用。
  2.4.4 TritonX-100法与NaOH提取法这两种方法,即不需液氮速冻研磨,也均不接触有毒试剂,可快速地制备水稻基因组DNA,用于SSR、STS等检测,效果稳定可靠。其中TritonX-100法提取的基因组DNA具有很好的完整性??捎糜诤笮渌肿由镅Р僮?。NaOH法提取的基因组DNA降解严重,要及时用于PCR操作。经检测,前者的OD值平均约为1.64,后者约为1.90;说明前者在一定程度上受到蛋白质的影响,而后者则排除了蛋白质污染。电泳显示,TritonX-100法提取的DNA电泳条带非常集中,表明该DNA很完整,而NaOH提取的DNA未见明显条带。呈弥散状,表明DNA已经严重降解。这两种提取法步骤相似,相对比较简单,只是刚开始加的试剂不同。NaOH法加入了Tris-HC1和NaOH,而TfitonX-100法除了加入Tris-HCl和NaCl,还加入了TritonX-100。这两种方法都是在离心管内匀浆植物材料,不需要液氮研磨,占据空间小,条件宽松,价格低廉,实际操作性很强,可同时快速处理多个样品。而且匀浆后不用转管,也避免了材料的损失和污染,因此尤其适用微量材料的DNA提取。用这两种方法提取DNA时,都需注意材料捣碎的程度,捣得太碎,虽然DNA释放更彻底,但一些影响PCR扩增效果的干扰因子也增多,扩增效果反而不好。要适度把握,以有可辨组织小块为宜。若?;竦媒洗罅康纳锨逡?,离心之前可用不锈钢棒将组织小块压到管底,以避免离心后漂浮的组织影响上清液的吸取。此外。选择幼嫩的材料可以提高提取的效率㈨。
  
  2.5微量提取法
  2.5.1微量法该方法使用了液氮,采用竹签将叶片捣碎,应用了类似钢珠法的提取方法。用此方法提取的水稻基因组DNA。外观呈透明胶体,TE溶解后经紫外分光光度计检测,其OD比值均为1.80-1.90,产率达到100 ng/μL,基本上没有蛋白质的污染。另外其电泳图谱显示,所得的DNA分子量较大,为20 kb以上长度的片断。且有较好的纯度,电泳条带较清晰。许多研究表明,在选取材料时,应尽可能挑取处于生长旺盛期的幼嫩组织,如幼嫩叶片和幼茎等材料,这时组织中蛋白质、多糖及酚类化合物都很少,并且由于细胞多数处于分裂期,DNA的产量也会很高。在研磨时不断加入液氮可以减少DNA受到的机械损伤和核酸酶的切割,但在保证DNA最小程度受到损伤的基础上应尽可能地充分研磨以破坏细胞壁,然后立即加入裂解缓冲液并置于65℃温水浴中,并不时地将反应体系颠倒混匀,使植物细胞充分裂解,释放DNA。此法经济简便,具有实验室通用性。另外,在提取样品通量和节省操作时间的基础上分离的DNA质量及可靠性也有保障。完全能满足分子生物学实验的需要。
  2.5.2筛选水稻突变体的DNA微量快速提取法这是一种高通量水稻DNA微量快速抽提法。该方法特别适用于精细作图群体和大型突变体库的筛选鉴定,不仅通量大、速度快,而且可以确保足够的DNA浓度和纯度。本方法采用96孔抽提板,强调高通量,尤其适用于大量样品的筛选检测。在遗传群体检测或突变体库筛选时,如果是F2和M:代群体材料,除要求能快速提取大量DNA外,还要求有足够含量的DNA。本方法符合这两方面的要求,关键是把叶片剪成碎片后放入抽提板孔中的速度要把握好,其他从加入提取液到DNA沉淀所需的时间与一般的微量提取法没有较大的差异。
  
  3 小结
  
  对于水稻基因组DNA的提取材料而言,幼叶是比较理想的材料。但研究者可根据不同的试验要求选择不同的材料。在方法上,不同方法提取的DNA各有其优点。在纯度和浓度方面,CTAB法是比较好的。在步骤简要方面,简化的CTAB法、剪切法、TritonX-100法、NaOH提取法等比较好。但在安全方面,不用有毒药品的就比较理想,例如上面提到水稻单粒种子DNA的快速制备。而对于对DNA纯度要求不高的一些PCR来说,煮沸法及微波炉法等无疑是比较理想的方法。若需要少量的DNA。那微量提取法就比较实用。以上各种提取方法都存在一些优势或缺点上的共性。所以研究者可以根据不同的侧重点及试验需要,选用不同的提取方法。

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