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猪场排污沟中大肠杆菌的分离鉴定和药敏试验

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  摘要:从荆州市8家猪场的排污沟采样100份,通过分离培养、染色镜检及生化鉴定,得到90株大肠杆菌菌株。对其进行药敏试验,试验结果表明大肠杆菌已经广泛存在耐药性,其中卡那霉素、庆大霉素、氨苄青霉素、青霉素、氯霉素、四环素、麦迪霉素和强力霉素的耐药率分别为54.44%、57.78%、66.67%、100.00%、53.33%、55.56%、41.11%和45.56%,其余的均在16%以上。试验表明所采样的猪场排污沟中的大肠杆菌耐药性广泛并具有多重耐药性,为今后生产上合理使用药物提供了理论依据。
中国论文网 http://www.egsf.org/8/view-8871961.htm
  猪大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的猪的一种急性传染病。主要表现为肠炎、肠毒血症等多种临床症状。该病在世界各地均有发生,在我国特别是养猪业发达的南方地区造成新生仔猪大批死亡或生长发育不良,成为发展养猪业的严重障碍之一。本研究以期掌握荆州市周边猪场的大肠杆菌耐药菌株的产生情况及扩散程度,为该地区的大肠杆菌病的防控提供依据。
  
  1 材料与方法
  
  1.1 材料
  1.1.1仪器与设备手提式高压灭菌锅、恒温培养箱、超净工作台、天平等。
  1.1.2培养基麦康凯琼脂、M-H、普通琼脂培养基等均按照参考文献的方法在实验室制备。
  1.1.3药敏纸片 购自杭州微生物试剂有限公司。纸片法药敏试验抑菌圈直径判断标准以美国实验室标准化委员会(UCCLS)制定的NCCL5200为依据。
  1.1.4采样来源于荆州周边的8家猪场的排污沟。
  
  1.2方法
  1.2.1 细菌的分离纯化将样品无菌接种于麦康凯琼脂平板上,37%培养18-24 h后观察菌落的生长情况。挑取中等大小的红色菌落,接种于伊红美蓝琼脂平板,置37%培养,同时用该菌落涂片。革兰氏染色、镜检,然后挑取典型菌落再接种于营养琼脂和营养肉汤中进行纯菌增殖。
  1.2.2生化鉴定 将纯化菌株分别接种于营养肉汤中,37%培养16-18 h,按参考文献[5]肠杆菌科细菌生化鉴定要求进行生化试验,观察并记录结果。
  1.2.3 菌种保存 将纯化的细菌用配制好的已灭菌的20%浓度的脱脂乳3 mL洗下混匀。用移液管分装到3个已灭菌的青霉素瓶中。用封口胶封口,置-20℃保存。
  1.2.4药敏试验
  1)细菌培养。挑取普通琼脂平板上生长的纯培养菌落接种于普通琼脂培养基,培养16-18 h,观察细菌生长情况。
  2)菌液的制备。用接种环挑取细菌接种于普通琼脂平板。37%培养18-24h,选择形态相同的菌落1-2个,用接种环挑起细菌接种到12 cm的培养皿中,用移液管吸取0.1 mL的无菌生理盐水滴入培养皿中。
  3)贴药敏纸片。用灭菌过的平推将细菌均匀地向一个方向涂布接种于M-H琼脂平板表面,然后将平板每转动60度涂布一次。共涂3次,最后沿平板边缘涂布一圈。盖上平皿盖,置室温下干燥3-5min,待平皿表面稍干后用无菌镊子将12种药敏纸片平放于琼脂平板表面,并轻压使其紧贴在上面。纸片应贴得均匀,各纸片中心距离不小于24 mm,纸片距平板内缘应不少于15 mm.37%培养18~24h。观察菌株的抑菌圈大小,并用最小刻度为毫米的直尺或游标卡尺,测量各抗生素对每株细菌抑菌圈的大小来判定其对药物的耐受性,并记录结果。
  
  2 结果与分析
  
  2.1 菌株鉴定
  从荆州周边8个不同猪场不同车间的排污沟采样的100份材料中共分离鉴定出大肠杆菌90株。其培养特性、染色反应、生化反应为:麦康凯琼脂上形成红色菌落:伊红美蓝琼脂上为紫黑色带(或不带)金属光泽;均为革兰氏阴性两端钝圆小杆菌,单在或成对;均可水解葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇并产酸;仅有少量产酸产气。M.R试验阳性,V-P试验阴性,均不产生硫化氢,硝酸盐还原试验阳性,尿素酶阴性,吲哚试验阳性,三铁酸斜面培养基产酸变黄,有气体无变黑现象。
  
  
  2.2 药物敏感性试验结果
  试验结果见表1,90株大肠杆菌的耐药水平较高,如氨苄青霉素、链霉素、四环素等,在12种抗生素中菌株普遍耐药5-6种,有的多达11种,说明菌株耐药谱也较广。调查还发现来自同一猪场的菌株耐药谱较一致,而来自不同猪场的菌株其耐药谱不尽相同。笔者认为这与不同猪场使用抗生素种类各异有关,也说明长时间使用单一抗生素是细菌产生耐药性的重要原因。因此兽医临床工作者应重视用药前的药物敏感性监测,选出几种有针对性的药物交替使用。以免延误治疗及造成药物浪费。

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